烯还原酶，顾名思义就是还原烯烃的酶。它与酮还原酶其实作用模式有点类似，一个是还原C=C，一个是还原C=O键。不过这里的C=C并不是孤立的双键，而是“活化了的双键”(activated C=C bonds)，比如α,β-不饱和醛酮酸酯等带吸电子基团的烯烃，其实基本都是Michael加成反应的“受体”，这样比较好理解。

 

我了解到应用比较多的烯还原酶是老黄酶家族的(Old Yellow enzymes，OYEs)，这一类酶是黄素-依赖的酶(Flavin-dependent ene reductases)，反应中虽然也需要加入NAD这样的辅酶，但真正与烯烃底物去作用的其实是另外的辅酶--黄素单核苷酸（FMN）。如下图的烯还原酶催化循环所示，NAD在酶(比如葡萄糖脱氢酶)的作用下被氢源(氢供体)还原为NADH，然后NADH将FMN还原为FMNH₂，这个才是真正与底物作用的还原试剂。整个催化过程中NAD和FMN是催化量的，被消耗的是氢源。

 

我们注意到很多辅酶其实都是维生素的衍生物，所以这就很好理解维生素对生物体的重要性了~

 

烯还原酶与酮还原酶和转氨酶相比应用较少，我之前见过的偏应用的例子就是OPRD里辉瑞的普瑞巴林烯还原酶路线，而且应该没有进行产业化应用。我们来看几个最新的例子：

 

第一个例子，GSK利用烯还原酶不对称还原3-取代环己烯酮底物39 和41，产物为手性环己酮衍生物。反应中同时搭配了葡萄糖脱氢酶(GDH)，以NADP作为辅酶，葡萄糖作为氢源。反应介质用的是pH=7.0的磷酸盐buffer，pH过高会导致副反应发生。酯基底物39用的是全细胞催化(whole cells)，所以酶的用量显得很多，不过两个反应的底物浓度都不是很大。

10.1002/chem.202103949  10.1021/acscatal.8b00624

 

另外例子来自Merck的一篇方法学文章，考察了一系列的取代丙烯酸底物通过烯还原酶不对称还原的效果，估计又是为他们某个项目做的技术储备？这个例子比较有意思的是用了一种新颖的NADPH再生技术，他们没有用常规的GDH+葡萄糖组合，而是用了一种次磷酸脱氢酶(phosphite dehydrogenase , PDH)+次磷酸盐的组合，这一组合的好处是用次磷酸盐作为氢源比较便宜，而且不需要控制体系的pH，因为产生的副产物本身就是磷酸盐，对体系pH冲击较小。

 

还有一个挑战就是这里的底物是丙烯酸，一般都是用酯来作为底物，因为活性更高，直接用羧酸的确实是第一回见到，每次看Merck的文章总是很受启发~

 

文章是方法学研究，有不少其他例子，感兴趣的可以下载原文学习。

10.1021/acs.orglett.0c02959

 

 

水解酶(Hydrolases)

 

水解酶的种类很多，一般常见的有酯水解酶(Lipase)，酰胺水解酶(amide hydrolase)，氰基水解酶(Nitrilase)，环氧化物水解酶(Epoxide Hydrolase)等，这一类酶一般是用于底物的动力学拆分(收率不超过50%，去对称化除外)。其中酯酶应该是最便宜，应用最成熟的酶了，而且都有商业化了的固定化酯酶，比如诺维信435。

 

来看几个例子：

第一个应用例子是Genentech 和 Roche的ipatasertib，构建一个手性甲基的片段。氰基水解酶选择性的水解其中一个构型的氰基为羧酸，保留目标产物，这一过程是动力学拆分，因此理论收率只有50%。

10.1021/acs.orglett.7b02228

 

第二个例子还是GSK的3-取代环己酮，上面用的烯还原酶，这里是酯酶和氰基水解酶。

10.1021/acs.oprd.8b00139

 

第三个例子，Merck利用猪肝酯酶(pig liver esterase)选择性水解3-甲基戊二酸二甲酯，得到手性单羧酸甲酯。由于底物是对称结构的，因此酯酶水解反应是去对称化过程，所以理论收率为100%，实际收率为96%，不过ee不算高。产物经过Curtius重排可以进一步合成手性4-甲基吡咯烷酮片段。

10.1021/acs.joc.9b00569

 

第四个是环氧化物水解酶(Epoxide Hydrolase)的应用例子，GSK用环氧化物水解酶动力学拆分消旋的环氧化物，用于GSK2330672的合成。

10.1021/acs.oprd.7b00179

 

 

氧化酶(Oxygenases)

 

第一个例子是BV氧化酶(Bayer-Villiger monooxygenases (BVMOs))，可以利用氧气将酮通过Bayer-Villiger重排转化成酯，或者将硫醚氧化为亚砜。与还原酶类似，这种氧化酶也是需要FMN作为辅酶，同时也需要NAD的协助。

如下面的BV氧化酶作用机理，还原型FMNH₂与氧气结合，形成过氧化物，然后与底物酮进行Bayer-Villiger反应得到酯，FMN又回到氧化型，可以被NADPH还原再生，回到还原型。所以，这类氧化酶的反应也需要搭配酮还原酶和辅酶NAD。

 

这个例子我在硫手性化合物那篇文章里其实介绍过了，阿斯利康的AZD6738，用Codexis的BVMO不对称氧化硫醚合成手性亚砜。反应中也使用了酮还原酶(KRED)，用NAD作为辅酶，异丙醇作氢源。

10.1021/acs.oprd.6b00391 & 10.1021/acscatal.9b03396

 

第二个BV氧化酶的例子是埃索美拉唑(esomeprazole)，这个项目之前的不对称合成方法是用化学法(酒石酸酯+Ti+过氧化物)。Codexis开发了用BVMOs的酶法新工艺，这个酶得来也不容易，他们从野生型出发经过19轮进化，最优的酶比开始提高了140,000倍~

10.1021/acs.joc.8b00468

 

第三个氧化酶的例子是脯氨酸羟化酶(proline hydroxylases (PHs))，诺华利用该酶可以在L-脯氨酸分子中引入羟基，合成不同的羟基脯氨酸。不过该例子用的并不是经过优化的酶，选择性较差，仅处于药化应用阶段。

10.1021/acs.oprd.1c00405

 

 

裂解酶(Lyases)

 

第一个例子是苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia lyase (PAL))，这种酶常规的作用是将苯丙氨酸脱氨裂解为肉桂酸，这里利用的是该酶催化反应的逆反应，反过来将肉桂酸衍生物在氨水中合成手性苯丙氨酸衍生物。

比如，诺华联合Codexis开发了 olodanrigan的酶催化合成工艺，就是利用改造的PAL以取代肉桂酸为底物合成手性苯丙氨酸，后者再通过Pictet-Spengler环化反应得到所需的手性环状氨基酸片段。

 

10.1021/acs.oprd.0c00217

 

第二个例子是芳基丙二酸脱羧酶(aryl malonate decarboxylase (AMDase))，辉瑞利用该酶应用于一系列芳基丙二酸，经过选择性脱羧得到手性α-芳基丙酸。很多已经上市的药物，像布洛芬，萘普生(Naproxen)等都含有这种结构。

 

由于底物是芳基丙二酸，本身就会自发脱羧，影响产物手性纯度。辉瑞的解决办法挺巧妙，他们利用苄酯通过钯碳氢化脱除苄基得到芳基丙二酸，并严格控制体系pH > 8.0，产生的丙二酸可以直接转化为钠盐，这一关键操作避免了自发脱羧，中间体可以直接用于下一步酶促脱羧反应，得到高手性纯度的产物。

 

10.1021/acs.oprd.0c00397

 

 

多酶联用(Multi-Step Enzymatic Cascades)

 

上面我们见识了不同类型的酶可以催化不同的反应，不过这些例子都是某种酶单打独斗的一步转化，那如果将多个酶联合起来使用是不是就可以进行多步实现多个反应类型的转化呢？这块内容就是介绍多酶联用的反应实例。

 

这里的多酶联用与合成生物学的模式有点类似，都是将底物通过多种酶的“接力”作用将其转化成所需要的化合物。但是两者还是有较大区别，我根据自己的理解列举几个：

1、反应场所，多酶联用其实就是把酶作为催化剂来使用，还是使用常规的反应容器，比如玻璃烧瓶，反应釜或者连续流等，反应可以是“一锅法”，也可以是分开进行的；而化学生物学的反应场所则是微生物的身体(当然也需要发酵罐)，也就是“细胞工厂”；

2、底物有区别，多酶联用的底物与目标产物结构还是比较接近的，但化学生物学用的是更加基础的原料(葡萄糖或甘油等)，发酵出来的产物有时会非常复杂，因此后者涉及酶催化的反应步骤可能也更多，过程也更复杂；

3、酶，多酶联用的酶是从细胞中分离出来的(全细胞除外)，比如粗酶液，纯化了的酶或固定化酶等，而化学生物学的酶还在活体的微生物中。

4、辅酶，多酶联用的辅酶需要额外添加进去(全细胞催化除外)，这也占一块成本，而化学生物学中微生物体内自带各种辅酶。

5、反应溶剂，多酶联用的反应除了水以外一般需要添加部分有机溶剂促溶(或者纯有机溶剂)，而化学生物学由于反应在微生物体内进行，介质就是水(细胞液)。

 

来看几个例子：

第一个例子，GSK团队利用酮还原酶和亚胺还原酶的串联反应实现了从醇到胺的“一锅法”转化。首先利用酮还原酶的逆反应将底物醇67氧化成醛，同时产生的NADH正好可以被下一步亚胺还原酶所利用，实现醛的还原氨化反应得到产物胺30。这个过程整体看是以“借氢反应”(hydrogen-borrowing)的方式进行，因此整个过程是Redox-Neutral的。

 

10.1038/s41929-019-0341-4

 

第二个例子是酮还原酶和转氨酶联用。辉瑞报道了利用酮还原酶和转氨酶联用合成具有两个手性中心的四氢吡喃衍生物。由于使用的转氨酶无法从消旋底物酮中转一性的识别所需构型，所以只能先利用酮还原酶把不要的构型反应掉，经过动力学拆分后得到单一构型的酮，再进行转氨化反应构建手性胺，经Boc保护后得到目标片段，反应的总收率为26%。

 

10.1021/acs.oprd.0c00557

 

第三个例子，Merck利用两种酮还原酶将消旋的仲醇通过氧化-还原串联反应转化成单一构型的手性醇。第一步反应是利用第一种酮还原酶在氧气的作用下将不要的构型选择性氧化为酮，然后再用第二种酮还原酶将酮还原为目标构型，两步反应总收率93%，产物ee >99%。

 

我没看这篇专利原文，不过这个结构很眼熟，我猜Merck做这个化合物应该是用来合成张万斌老师的那个手性咪唑催化剂的，Merck利用张老师这个催化剂开发了一种不对称合成手性磷酰胺的新方法，用于合成他们的山寨丙肝药MK-3682，相关工作发表在Science上(10.1126/science.aam7936)。我写关于磷手性的那篇文章时漏了这篇高级paper，正好在这里补上~

 

US2020/0123585

 

第四个例子，赖氨酸环化脱胺酶(Lysine Cyclodeaminase)与脯氨酸羟化酶(Proline Hydroxylase)串联。Merck联合Codexis利用野生型的赖氨酸环化脱胺酶与改进的脯氨酸羟化酶，以L-赖氨酸为原料“一锅法”合成手性5-羟基-2-哌啶羧酸的酶催化方法。

 

US2017/0355968

 

第五个例子，Merck开发了一条利用五种酶串联的方法合成核苷类抗病毒药物islatravir。反应以2-炔基丙三醇出发分别经过了以下5个反应过程：

1) 半乳糖氧化酶(galactose oxidase (GOase))进行去对称化-氧化；

2) 激酶PanK(kinase PanK) 和乙酸激酶(acetate kinase (AcK))的作用下进行羟基磷酸化；

3) 脱氧核糖磷酸醛缩酶(deoxyribose phosphate aldolase (DERA))催化下与乙醛缩合得到炔基戊糖；4) 磷酸戊糖变位酶(phosphopentamutase (PPM))将磷酸基转移至苷羟基，对底物进行异构&活化(选择性得到α-型磷酸酯)；

5)嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase (PNP)) 催化磷酸戊糖与2-氟腺嘌呤进行糖苷化，得到islatravir。产生的磷酸根被蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase (SP))清除，以促进整个反应平衡。

整个串联酶催化过程共5步化学反应，共涉及到了7种酶，其中5种酶直接对底物进行“接力”转化，2种酶起辅助作用。

真是让人开眼了，这一阵势不亚于化学生物学，相关工作发表在Science上~

 

 

10.1126/science.aay8484

 

第六个例子是MK-1454的多酶联用合成工艺。MK-1454是Merck开发的一种硫代环二核苷酸衍生物，由于含有手性硫代磷酸基团，合成难度非常大。

Merck利用四种酶串联催化漂亮的完成了该药物分子的合成，用到的酶分别是鸟苷酸激酶(guanylate kinase (GK) )、腺苷酸激酶(adenylate kinase (AK))、乙酸激酶(acetate kinase (AcK))以及环鸟苷-腺苷酸合成酶 (cyclic guanosine-adenosine synthase (cGAS))。

 

 

10.1038/s41586-022-04422-9 & 10.1021/jacs.1c12106

 

最后一个例子还是来自于Merck(在这一领域简直是bug般的存在)。这个药物分子是Merck的抗新冠药物--molnupiravir。

Merck从核糖出发，分别利用Novozymes 435固定化酯酶，甲基硫核糖激酶(5-S-methylthioribose (MTR) kinase)，尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase (UP))经过3步反应得到molnupiravir。该酶催化工艺不仅比原先的化学法步骤短，而且总收率是7倍之多！

10.1021/acscentsci.1c00608

 

 

总结

 

酶催化给人的印象就是它的优点：“绿色”，高效，反应条件温和，底物专一性强，产物的手性纯度高等等，最关键的是能做的成本很低。

 

不过，酶催化除了这些优点外也还是有些缺陷，比如酶催化门槛相对比较高，普通玩家往往要么自己找不到合适的酶，要么搞不定酶的来源；二是要有一定水平的合成人员去设计开发合适的酶催化底物合成工艺，要用酶催化反应，首先得能想到用酶去做这个反应才行；还有酶催化反应的后处理也是个问题，酶像胶体一样很难过滤，而且酶的残留也要严格控制，毕竟是生物活性物质(关于这一问题可以看下这两篇文献Org. Process Res. Dev. 2012, 16, 1986-1993 & Org. Process Res. Dev. 2016, 20, 594-601)。

 

本文部分内容参考自辉瑞酶催化综述(10.1021/jacsau.2c00712)，要我说国际化大公司也有狭隘的一面，它这里面引用的文献基本都是国外公司的文章。其实开始就说过，最近几年我们国内不管是高校还是药企很多在酶催化这块做的相当不错的，比如天津工生所的朱敦明课题组，陈芬儿院士团队等开发了很多药物合成酶催化新工艺。企业的优秀代表比如凯莱英等(其他的我就不列举了，又不给我广告费，哈哈)。

 

其实，除了工业化应用以外，最近几年酶催化的纯学术应用也相当亮眼，比如将光反应和酶催化反应相结合的光酶协同催化反应(Photoenzymatic synthesis or Photobiocatalysis)，利用光照活化产生的高活性中间体(自由基)被酶催化反应捕获可以开发新的反应类型，扩展酶催化的应用范围。这些文章还都是些高质量paper，比如10.1126/science.adg2420，10.1038/s41929-023-01065-5等。